一陣濃郁的蕉香襲擊著(zhù)黑暗中的一只果蠅，它“嗡嗡”地興奮起來(lái)，振翅要湊過(guò)去。科技日報記者近日走訪(fǎng)北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)現，研究人員正在試圖捕捉這只被釘在顯微鏡下的果蠅的“思想活動(dòng)”。“我們可以直接觀(guān)測到，果蠅感應到氣味之后，腦中的多巴胺濃度變化。”正在做實(shí)驗的博士生曾健智說(shuō)，“一會(huì )兒還會(huì )給它一些電信號刺激，觀(guān)察腦中多巴胺在不同刺激下的響應。”

“聞香起舞”這個(gè)簡(jiǎn)單的畫(huà)面在“腦圖譜”的維度是復雜的——香蕉揮發(fā)出的香氣分子被果蠅的嗅覺(jué)細胞捕獲，激發(fā)了嗅覺(jué)細胞通路中的信號轉換，將化學(xué)信號轉變?yōu)樯窠?jīng)電信號傳送至腦，電信號的到來(lái)催促著(zhù)體內多巴胺的分泌，通過(guò)打開(kāi)細胞內的通路，將神經(jīng)信號中氣味分子的信息傳遞出來(lái)。

如同“多米諾骨牌”，外界的刺激一張張傳遞下去，激起了生物體的反應。由于多年來(lái)對活體動(dòng)物思維的即時(shí)、定位觀(guān)測始終未能實(shí)現，這些反應具體發(fā)生在大腦中的哪個(gè)部分，人類(lèi)仍無(wú)從得知。日前，新一期《細胞》雜志刊登了北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員李毓龍團隊的研究成果：通過(guò)基因構建的方法，他們開(kāi)發(fā)出多巴胺熒光探針，宛如在深邃的思想迷宮中點(diǎn)燃“火把”，為此類(lèi)相關(guān)研究“照亮”了多巴胺神經(jīng)環(huán)路。

動(dòng)態(tài)示蹤多巴胺信號變化

“將水母中的熒光基因和人源G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)基因聯(lián)合在一起，我們獲得了可以動(dòng)態(tài)示蹤多巴胺的工具。”李毓龍告訴科技日報記者，這聽(tīng)起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是神經(jīng)活動(dòng)的特性對探針提出了嚴苛要求。神經(jīng)活動(dòng)是稍縱即逝的，它必須反應迅速;多巴胺的生成可能是痕量的，因此它必須敏銳;示蹤多巴胺必須可信不“犯錯”，它必須準確無(wú)誤……只有符合這些鐵一般的律條，才具備資格成為廣泛應用的研究工具。

打磨工具的“原材料”正是能夠和多巴胺結合的GPCR。“它是一個(gè)跨膜蛋白，它在結合多巴胺后會(huì )引發(fā)自身的構象變化，我們想，如果能夠讓這樣的構想變化產(chǎn)生熒光，或能解決問(wèn)題。”論文第一作者之一的北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士井淼解釋道。這可以通俗地比喻為，多巴胺“按下”的按鍵此前只打開(kāi)了大門(mén)，而要打造的新工具能讓打開(kāi)的大門(mén)同時(shí)亮燈。

為此，團隊選擇了5種GPCR亞型作為備選原材料。“我們利用分子克隆的方法將編碼熒光蛋白的基因與五種多巴胺受體的基因拼接起來(lái)，通過(guò)對融合蛋白的表達、定位及受體對多巴胺的親和力等指標篩選出最好的亞型。”井淼說(shuō)。

人工“拼接”后的基因表達會(huì )不會(huì )被細胞“認可”?打造一款高效“探針”的第一個(gè)阻礙來(lái)自細胞內部。“正常的GPCR是膜蛋白，要檢測細胞外出現的多巴胺信號，蛋白必須要上膜，加了熒光蛋白以后，GPCR的性質(zhì)可能會(huì )變化，無(wú)法上膜。”井淼說(shuō)。

精密運轉的細胞在“零件”被改變之后能否正常運轉、經(jīng)過(guò)修飾的全新蛋白能否“繼承”原有的功能、基因遵循密碼子原則轉錄翻譯為氨基酸序列之后的蛋白裝配是否能完成抵達細胞膜發(fā)揮作用的任務(wù)等都是擺在課題組面前的“攔路虎”。

抵達膜上僅僅是第一步。“要想GPCR接受信號分子多巴胺后產(chǎn)生的扭轉牽動(dòng)熒光蛋白扭轉后發(fā)光，兩個(gè)蛋白的連接方式起決定作用。”井淼解釋?zhuān)坝械那闆r下，受體的構象改變可能無(wú)法有效傳遞給熒光蛋白以產(chǎn)生熒光變化。”

知己知彼，百戰百勝。由于對GRCR蛋白三維構象、核心基團、結構作用力等的精準了解，李毓龍團隊對其基因水平上的改造和雕琢，能夠做到恰到好處。實(shí)驗證明，長(cháng)時(shí)間表達該探針對模式生物的生長(cháng)狀態(tài)無(wú)明顯影響。利用該探針，他們檢測到了電刺激小鼠腦片引發(fā)的多巴胺釋放，并在活體果蠅、斑馬魚(yú)和小鼠的大腦中檢測到了與嗅覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、學(xué)習記憶、交配行為相關(guān)的多巴胺信號變化。

精益求精，探針靈敏度不斷“進(jìn)化”

“人們可能從來(lái)不知道這里有神經(jīng)信號釋放，但是如果有一個(gè)非常靈敏的探針，就可能會(huì )看到。”井淼說(shuō)，文章接收后，團隊始終在進(jìn)行探針的優(yōu)化工作，如今的探針比論文中的更加靈敏。

如果將人腦比喻成一張聯(lián)絡(luò )圖，科學(xué)家想要做的是按圖索驥，尋找例如記憶、情感等對應的神經(jīng)活動(dòng)的詳細內容。而未來(lái)這張圖的清晰度如何，是雪花、省流、標清、高清還是1080P，則完全取決于探針的靈敏度。

在突破了第一個(gè)阻礙之后，探針迎來(lái)了“修煉式”優(yōu)化。“我們知道要把熒光蛋白的基因和特定的GPCR基因連在一起，可是怎么連才最優(yōu)呢?”井淼說(shuō)，靠左一點(diǎn)還是靠右一點(diǎn)，也可能需要在中間加一座連接的橋梁，橋梁又該怎么設計，這其中能排列組合出的方案數不勝數。

“我們通過(guò)找到一些對探針與多巴胺反應起到關(guān)鍵作用的位點(diǎn)，對基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，取得了探針優(yōu)化的效果。”井淼介紹，實(shí)驗中突變帶來(lái)的結果可能有好有壞，突變后會(huì )測試其與多巴胺的反應，篩選出“改良版”，這些“改良版”隨后還會(huì )進(jìn)行組合嘗試，不斷篩選與優(yōu)化，向著(zhù)更高的靈敏度“進(jìn)化”。經(jīng)過(guò)500多個(gè)突變的嘗試，團隊最終獲得了具有高、低親和力的兩種版本探針，適用于多巴胺釋放量不同的腦區。

李毓龍認為，探針靈敏度在未來(lái)的持續優(yōu)化和篩選中將可能不斷提高，使其有能力示蹤更多未知的神經(jīng)通路，發(fā)現人類(lèi)不曾觀(guān)測到、還不知曉的神經(jīng)系統秘密。

捕捉神經(jīng)活動(dòng)，從“閃爍”變?yōu)椤岸嗖省?/p>

由于神經(jīng)元在放電的時(shí)候會(huì )爆發(fā)出一個(gè)短暫的鈣離子濃度高峰，神經(jīng)元鈣離子成像技術(shù)至今依然是人們觀(guān)測神經(jīng)活動(dòng)最為直接的手段。“雖然鈣離子成像能夠同時(shí)反應成百上千個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)，但由于許多神經(jīng)遞質(zhì)都可以引發(fā)細胞內鈣信號的變化，因此單純通過(guò)鈣成像難以知曉是何種神經(jīng)遞質(zhì)在發(fā)揮作用。”井淼說(shuō)。

有文章評價(jià)，有了鈣成像技術(shù)，原本悄無(wú)聲息的神經(jīng)活動(dòng)就變成了一幅閃爍的壯觀(guān)影像。然而這種“全面開(kāi)花”的成像方式難以“定點(diǎn)”“定性”反應精細的問(wèn)題。

“神經(jīng)元的興奮性變化是否是多巴胺介導的?是某一個(gè)神經(jīng)元細胞始終分泌了多巴胺，還是分階段分泌不同濃度的多巴胺?是一整個(gè)神經(jīng)元細胞的活動(dòng)，還是神經(jīng)元細胞中不同突觸的活動(dòng)?回答這些問(wèn)題，才有可能弄清一些神經(jīng)系統疾病的病理，從而有針對性地開(kāi)發(fā)藥物。”李毓龍說(shuō)。

如果說(shuō)，鈣離子成像技術(shù)解決的是科學(xué)家終于可以“目擊”神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )之中往來(lái)穿梭的問(wèn)題，那么多巴胺熒光探針技術(shù)解決的是逐一“狙擊”神經(jīng)信號與現實(shí)的對應關(guān)系。

與此同時(shí)，李毓龍團隊還首次成功開(kāi)發(fā)了靈敏、特異、可遺傳編碼的乙酰膽堿熒光探針，并成功在不同生物體系中實(shí)時(shí)檢測內源乙酰膽堿信號，相關(guān)論文日前已在《自然·生物技術(shù)》雜志發(fā)表。可以想見(jiàn)，當每一種神經(jīng)遞質(zhì)有一個(gè)不同顏色的探針對應，那神經(jīng)活動(dòng)將從之前的“閃爍”變?yōu)椤岸嗖省保煌伾聿煌纳窠?jīng)活動(dòng)。有了趁手的工具，人們將在獲得“腦圖譜”的研究中邁進(jìn)一大步。